5.4. Ph­¬ng ph¸p s¾c ký líp máng

Ph­¬ng ph¸p s¾c ký líp máng ®­îc dïng ®Ó ®Þnh tÝnh, thö tinh khiÕt vµ ®«i khi ®Ó b¸n ®Þnh l­îng hoÆc ®Þnh l­îng ho¹t chÊt thuèc.

S¾c ký líp máng lµ mét kü thuËt t¸ch c¸c chÊt ®­îc tiÕn hµnh khi cho pha ®éng di chuyÓn qua pha tÜnh trªn ®ã ®· chÊm hçn hîp c¸c chÊt cÇn t¸ch. Pha tÜnh lµ chÊt hÊp phô ®­îc chän phï hîp theo tõng yªu cÇu ph©n tÝch, ®­îc tr¶i thµnh líp máng ®ång nhÊt vµ ®­îc cè ®Þnh trªn c¸c phiÕn kÝnh hoÆc phiÕn kim lo¹i. Pha ®éng lµ mét hÖ dung m«i ®¬n hoÆc ®a thµnh phÇn ®­îc trén víi nhau theo tû lÖ quy ®Þnh trong tõng chuyªn luËn. Trong qu¸ tr×nh di chuyÓn qua líp hÊp phô, c¸c cÊu tö trong hçn hîp mÉu thö ®­îc di chuyÓn trªn líp máng, theo h­íng pha ®éng, víi nh÷ng tèc ®é kh¸c nhau. KÕt qu¶ thu ®­îc lµ mét s¾c ký ®å trªn líp máng. C¬ chÕ cña sù t¸ch cã thÓ lµ c¬ chÕ hÊp phô, ph©n bè, trao ®æi ion, sµng läc ph©n tö hay sù phèi hîp ®ång thêi cña nhiÒu c¬ chÕ tïy thuéc vµo tÝnh chÊt cña chÊt lµm pha tÜnh vµ dung m«i lµm pha ®éng.

§¹i l­îng ®Æc tr­ng cho møc ®é di chuyÓn cña chÊt ph©n tÝch lµ hÖ sè di chuyÓn R_f ®­îc tÝnh b»ng tû lÖ gi÷a kho¶ng dÞch chuyÓn cña chÊt thö vµ kho¶ng dÞch chuyÓn cña dung m«i:

 

                                               

 

Trong ®ã: a lµ kho¶ng c¸ch tõ ®iÓm xuÊt ph¸t ®Õn t©m cña vÕt mÉu thö, tÝnh b»ng cm.

b lµ kho¶ng c¸ch tõ ®iÓm xuÊt ph¸t ®Õn møc dung m«i ®o trªn cïng ®­êng ®i cña vÕt, tÝnh b»ng cm.

R_f: ChØ cã gi¸ trÞ tõ 0 ®Õn l.

Ngoµi ra, khi s¾c ký liªn tôc kh«ng x¸c ®Þnh ®­îc tuyÕn dung m«i, vÞ trÝ vÕt chÊt thö trªn s¾c ®å cã thÓ x¸c ®Þnh b»ng hÖ sè dÞch chuyÓn t­¬ng ®èi Rr. HÖ sè dÞch chuyÓn t­¬ng ®èi Rr ®­îc x¸c ®Þnh b»ng tû sè gi÷a kho¶ng c¸ch dÞch chuyÓn cña vÕt chÊt thö vµ kho¶ng c¸ch dÞch chuyÓn cña vÕt chÊt chuÈn ®èi chiÕu ®­îc s¾c ký trong cïng ®iÒu kiÖn vµ trªn cïng b¶n máng víi mÉu thö:

                                                 

 

Trong ®ã: a lµ kho¶ng c¸ch tõ ®iÓm xuÊt ph¸t ®Õn t©m cña vÕt mÉu thö, tÝnh b»ng cm.

c lµ kho¶ng c¸ch tõ ®iÓm xuÊt ph¸t ®Õn t©m cña vÕt chÊt chuÈn, tÝnh b»ng cm.

Gi¸ trÞ Rr cã thÓ lín hay nhá h¬n l.

C¸ch tiÕn hµnh

Dông cô

B×nh triÓn khai, th­êng b»ng thuû tinh trong suèt cã kÝch th­íc phï hîp víi c¸c phiÕn kÝnh cÇn dïng vµ cã n¾p ®Ëy kÝn.

§Ìn tö ngo¹i, ph¸t c¸c bøc x¹ cã b­íc sãng ng¾n 254 nm vµ b­íc sãng dµi 365 nm.

Dông cô ®Ó phun thuèc thö.

Tñ sÊy ®iÒu nhiÖt ®Ó ho¹t hãa vµ sÊy b¶n máng vµ s¾c ký ®å, hoÆc ®Ó sÊy nãng ®èi víi mét sè ph¶n øng ph¸t hiÖn.

Tñ hót h¬i ®éc.

M¸y sÊy dïng ®Ó sÊy kh« s¾c ký ®å vµ cho phÐp chÊm nhanh nhiÒu lÇn nh÷ng dung dÞch pha lo·ng chÊt cÇn ph©n tÝch.

Mét m¸y ¶nh tèt cã thÓ chôp l­u gi÷ s¾c ký ®å ë ¸nh s¸ng ban ngµy víi kho¶ng c¸ch 30 - 50 cm.

Tñ l¹nh ®Ó b¶o qu¶n nh÷ng thuèc thö dÔ háng.

Micropipet nhiÒu cì tõ l, 2, 5, 10 ®Õn 20 ml, c¸c èng mao qu¶n hoÆc dông cô thÝch hîp.

B¶n máng tr¸ng s½n chÊt hÊp phô cã chÊt ph¸t quang thÝch hîp.

Tr­êng hîp phßng thÝ nghiÖm kh«ng cã ®iÒu kiÖn trang bÞ c¸c lo¹i b¶n máng tr¸ng s½n th× tù chuÈn bÞ lÊy b¶n máng víi c¸c dông cô sau ®©y:

C¸c tÊm kÝnh ph¼ng cã kÝch th­íc phï hîp ®· ®­îc xö lý tr­íc b»ng hãa chÊt råi röa s¹ch b»ng n­íc vµ sÊy kh«.

ThiÕt bÞ tr¶i chÊt hÊp phô lªn tÊm kÝnh thµnh mét líp máng ®ång ®Òu, cã chiÒu dµy thÝch hîp.

Gi¸ ®Ó xÕp c¸c tÊm kÝnh ®· tr¶i.

ChuÈn bÞ b¶n máng

S¾p xÕp c¸c b¶n máng vµ chuÈn bÞ thiÕt bÞ: C¸c phiÕn kÝnh ph¶i ®­îc lau chïi cÈn thËn vµ tÈy s¹ch hoµn toµn c¸c chÊt bÐo b»ng c¸ch ng©m trong dung dÞch sulfocromic. Sau ®ã, röa d­íi tia n­íc m¸y råi tr¸ng n­íc cÊt vµ lµm kh« trªn gi¸ ë nhiÖt ®é th­êng hay trong tñ sÊy. §Æt lªn khung tr¶i 5 phiÕn kÝnh 20 x 20 cm (hay phiÕn kÝnh 10 x 20 cm) dµy b»ng nhau. §iÒu chØnh ®é dµy cña líp hÊp phô b»ng c¸c th«ng sè trªn thiÕt bÞ tr¶i.

§iÒu chÕ v÷a cña chÊt hÊp phô: ChÊt hÊp phô ®­îc chän läc sao cho phï hîp víi yªu cÇu ph©n tÝch nh­: Silicagel G, kieselguhr, cel1u1ose, nh«m oxyd, trong sè ®ã silicagel G ®­îc dïng th«ng dông nhÊt. Trén 25g silicagel G víi 50 ml n­íc cÊt vµ nhµo trong cèi hoÆc l¾c m¹nh trong b×nh nãn cã dung tÝch 200 - 250 ml, nót kÝn, trong 30 - 45 gi©y. DÞch treo t¹o ®­îc ë d¹ng láng vµ ®ång nhÊt. Rãt ngay vµo thiÕt bÞ tr¶i ®· ®iÒu chØnh ®é dµy cho b¶n máng kho¶ng 0,25 mm (nÕu kh«ng cã chØ dÉn trong chuyªn luËn riªng). Sau khi rãt dÞch treo vµo thiÕt bÞ tr¶i, lËt tay ®ßn 180^o vÒ phÝa tr¸i vµ chê cho ®Õn khi dÞch treo ch¶y ra th× b¾t ®Çu tr¶i. Khi ®· tr¶i ®Õn phiÕn cuèi cïng lËt tay ®ßn vÒ phÝa ph¶i ®Ó gi÷ cho dÞch treo kh«ng ch¶y xuèng.

§Ó ngôyªn c¸c phiÕn kÝnh t¹i chç kho¶ng 10 phót tíi khi mÆt trªn hÕt bãng, hoÆc ®Ó kh« tù nhiªn t¹i nhiÖt ®é phßng.

Ho¹t hãa: Cho c¸c b¶n máng ®· kh« mÆt vµo tñ sÊy vµ sÊy ë l05 - l10^oC trong 30 phót (nÕu kh«ng cã chØ dÉn ë chuyªn luËn riªng). §Ó nguéi råi b¶o qu¶n trong b×nh hót Èm. Khi dïng, nÕu cÇn th× ho¹t hãa l¹i b»ng c¸ch sÊy ë l05 - l10⁰C trong l giê råi c¹o bá mét d¶i chÊt hÊp phô däc hai bªn c¹nh cña tÊm kÝnh.

ChuÈn bÞ b×nh khai triÓn: C¸c b×nh khai triÓn th­êng lµ b×nh thñy tinh, h×nh hép hay h×nh trô, cã n¾p ®Ëy kÝn, kÝch th­íc thay ®æi tïy theo yªu cÇu cña c¸c b¶n máng sö dông. B·o hßa h¬i dung m«i vµo khÝ quyÓn trong b×nh b»ng c¸ch lãt giÊy läc xung quanh thµnh trong cña b×nh, råi rãt mét l­îng võa ®ñ dung m«i vµo b×nh, l¾c råi ®Ó giÊy läc thÊm ®Òu dung m«i. L­îng dung m«i sö dông sao cho sau khi thÊm ®Òu giÊy läc cßn l¹i mét líp dµy kho¶ng 5 mm ®Õn 10 mm ë ®¸y b×nh. §Ëy kÝn n¾p b×nh vµ ®Ó yªn l giê ë nhiÖt ®é 20 - 25^oC. Muèn thu ®­îc nh÷ng kÕt qu¶ lÆp l¹i, ta chØ nªn dïng nh÷ng dung m«i thËt tinh khiÕt, lo¹i dïng cho s¾c ký. Nh÷ng dung m«i dÔ bÞÕn ®æi vÒ hãa häc chØ nªn pha tr­íc khi dïng. NÕu sö dông nh÷ng hÖ pha ®éng phøc t¹p ph¶i chó ý ®Õn nh÷ng thµnh phÇn dÔ bay h¬i lµm thay ®æi thµnh phÇn cña hÖ pha ®éng dÉn ®Õn hiÖn t­îng kh«ng lÆp l¹i cña trÞ sè R_f.

ChÊm chÊt ph©n tÝch lªn b¶n máng: L­îng chÊt hoÆc hçn hîp chÊt ®­a lªn b¶n máng cã ý nghÜa quan träng ®èi víi hiÖu qu¶ t¸ch s¾c ký, ®Æc bÞÖt ¶nh h­ëng rÊt lín ®Õn trÞ sè R_f. L­îng chÊt qu¸ lín lµm cho vÕt s¾c ký lín vµ kÐo dµi, khi ®ã, vÕt cña c¸c chÊt cã trÞ sè R_f gÇn nhau sÏ bÞ chång lÊp. L­îng chÊt nhá qu¸ cã thÓ kh«ng ph¸t hiÖn ®­îc do ®é nh¹y cña thuèc thö kh«ng ®ñ (th«ng th­êng ®é nh¹y cña c¸c thuèc thö trªn 0,005 mg). L­îng mÉu th«ng th­êng cÇn ®­a lªn b¶n máng lµ 0,l - 50 mg ë d¹ng dung dÞch trong dung m«i thÝch hîp. ThÓ tÝch dung dÞch tõ 0,001 ml ®Õn 0,005 ml ®èi víi tr­êng hîp ®­a mÉu lªn b¶n máng d­íi d¹ng ®iÓm vµ tõ 0,l - 0,2 ml khi ®­a mÉu lªn b¶n máng d­íi d¹ng v¹ch nh­ trong tr­êng hîp s¾c ký ®iÒu chÕ. §èi víi c¸c dung dÞch cã nång ®é rÊt lo·ng th× cã thÓ lµm giµu trùc tiÕp trªn b¶n máng b»ng c¸ch chÊm nhiÒu lÇn ë cïng mét vÞ trÝ vµ sÊy kh« sau mçi lÇn chÊm.

§­êng xuÊt ph¸t ph¶i c¸ch mÐp d­íi cña b¶n máng l,5cm - 2 cm vµ c¸ch bÒ mÆt dung m«i tõ 0,8 - l cm. C¸c vÕt chÊm ph¶i nhá, cã ®­êng kÝnh 2 - 6 mm vµ c¸ch nhau 15 mm. C¸c vÕt ë b×a ph¶i c¸ch bê bªn cña b¶n máng Ýt nhÊt 1 cm ®Ó tr¸nh hiÖu øng bê. Khi lµm s¾c ký líp máng b¸n ®Þnh l­îng, ®é chÝnh x¸c cña kÕt qu¶ ph©n tÝch phô thuéc rÊt nhiÒu vµo ®é chÝnh x¸c cña l­îng chÊt thö ®­a lªn b¶n máng, tøc lµ thÓ tÝch dung dÞch chÊm lªn b¶n máng. Do ®ã, víi nh÷ng tr­êng hîp ph©n tÝch b¸n ®Þnh l­îng ph¶i dïng c¸c mao qu¶n ®Þnh møc chÝnh x¸c. Khi kh«ng cÇn ®Þnh l­îng dïng micropipet hoÆc èng m¶o qu¶n th­êng.

TriÓn khai s¾c ký: §Æt b¶n máng  vµo b×nh triÓn khai.  Chó ý l­îng dung m«i dïng ®Ó c¸c vÕt chÊm ph¶i ë trªn bÒ mÆt cña líp dung m«i. §Ëy kÝn b×nh vµ ®Ó triÓn khai ë nhiÖt ®é tõ 20 - 25^o C vµ tr¸nh ¸nh mÆt trêi. Khi dung m«i ®· triÓn khai trªn b¶n máng ®­îc mét ®o¹n theo quy ®Þnh trong chuyªn luËn, lÊy b¶n máng ra khái b×nh, ®¸nh dÊu møc dung m«i, lµm bay h¬i dung m«i cßn ®äng l¹i trªn b¶n máng råi hiÖn vÕt theo chØ dÉn trong chuyªn luËn riªng. Quan s¸t c¸c vÕt xuÊt hiÖn, tÝnh gi¸ trÞ R_f hoÆc Rr vµ tiÕn hµnh ®Þnh tÝnh, ph¸t hiÖn t¹p chÊt hoÆc ®Þnh l­îng nh­ quy ®Þnh trong chuyªn luËn riªng.

Chó ý:

Khi ph©n tÝch b»ng s¾c ký líp máng lu«n ph¶i chÊm chÊt ®èi chiÕu bªn c¹nh vÕt chÊt thö  víi l­îng t­¬ng tù nh­ dù ®o¸n cã trong vÕt chÊt thö ®Ó so s¸nh kÕt qu¶ vÒ mµu s¾c, kÝch th­íc vµ gi¸ trÞ R_f hoÆc Rr trong cïng ®iÒu kiÖn.

HiÖu n¨ng cña b¶n máng ®­îc kiÓm tra nh­ sau: ChÊm mét thÓ tÝch thÝch hîp (10 ml ) cho líp máng th«ng th­êng vµ 1 ml  ®Õn 2 ml cho lo¹i b¶n máng cã kÝch th­íc h¹t mÞn) dung dÞch thö hiÖu n¨ng líp máng gåm lôc bromocresol, da cam methyl, ®á methyl vµ sudan G ®á (thuèc thö). TiÕn hµnh s¾c ký víi hÖ dung m«i  methanol – toluen ( 20 : 80). KÕt qu¶ trªn s¾c ký ®å ph¶i cã 04 vÕt t¸ch râ rµng cã R_f nh­ sau: Lôc bromocresol : < 0,15;  da cam methyl: 0,1 - 0,25, ®á methyl:  0,35 - 0, 55 vµ sudan G ®á:  0, 75 - 0, 98.